Regulacja ekspresji genów u bakterii w procesie po-transkrypcyjnym

Nasze laboratorium skupia się na zrozumieniu koordynacji między targetowaniem RNA, degradacją RNA i translacją u bakterii.

Większość gatunków bakterii jest nieszkodliwa i często korzystna, ale inne mogą powodować choroby zakaźne. Ekspresja genów związanych z wirulencją jest często regulowana poprzez białko czaperonowe Hfq i małe RNA (sRNA). Hfq umożliwia parowanie między sRNA a docelowym mRNA, co prowadzi do regulacji docelowego mRNA. Regulacja następuje głównie poprzez zmianę inicjacji translacji lub degradacji RNA. Degradacja RNA u bakterii jest ułatwiana przez degradosom, kompleks rybonukleazy E (RNazy E), enolazy, helikazy RhlB i PNPazy.

Rys. 1. Regulacja ekspresji genów u bakterii w procesie po-transkrypcyjnym za pomocą białka Hfq i małych RNA.

Proces składania kompleksu degradosomu z mRNA może również nastąpić wcześniej niż złożenie kompleksu mRNA-sRNA-Hfq. Pierwszy kompleks może potencjalnie być bardziej skuteczny w regulacji docelowego mRNA w porównaniu z sekwencyjnym kierowaniem przez sRNA i degradosom. Ponieważ kompleksy tworzą się poprzez alternatywne szlaki, zbadamy również, czy mechanizm ich tworzenia wpływa na wynik regulacji.

Ponadto kompleksy degradujące RNA w komórkach próbują wiązać mRNA, który prawdopodobnie podlega translacji. Koordynacja pomiędzy targetowaniem, degradacją i translacją jest kluczowa dla efektywnej regulacji mRNA. Jednak jak te proces odbywają się w czasie rzeczywistym nie zostało zbadane. Aby to zbadać, zrekonstruujemy aktywną translację in vitro i sprawdzimy tworzenie się kompleksów kierujących i degradujących.

Mikroskopia pojedynczej cząsteczki TIRF

Skutki działania sRNA na ekspresję genów obserwuje się już w ciągu 1-2 minut od indukcji sygnału, jednak nie rozumiemy w pełni, jak koordynacja między tymi procesami zachodzi tak skutecznie w tak krótkiej skali czasowej. Aby poradzić sobie z tym problemem, musimy monitorować tworzenie się kompleksów RNA-białko w czasie rzeczywistym na skalach czasowych istotnych in vivo. Ponadto los pojedynczych sRNA może się różnić, np. niektóre sRNA mogą nie związać się z białkiem lub nie znaleźć odpowiedniego mRNA.

Aby naprawdę zagłębić się w molekularny mechanizm działania sRNA, potrzebujemy metody, która:

• zapewnia wysoką rozdzielczość czasową (w skali milisekund do minut),
• zapewnia rozdzielczość przestrzenną do rozwiązywania zmian konformacji kompleksów RNA-białko lub RNA-RNA,
• umożliwia wizualizację różnych ścieżek składania kompleksów.

Mikroskopia pojedynczej cząsteczki TIRF pozwala na wizualizację setek biomolekuł unieruchomionych na mikroskopowym szkiełku. Jednak każda cząsteczka jest analizowana osobno. Cząsteczki są znakowane fluorescencyjnie, a interakcje są wykrywane przez kolokalizację fluoroforów lub FRET.